熒光探針的一些知識

在描述熒光探針時(shí)常用到下述的一些基本概念，在選擇使用熒光探針時(shí)應予考慮。
（一）熒光的激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng)
　　熒光探針大多是含有共扼雙鍵體系的有機化合物，容易吸收近紫外區或可見(jiàn)光區的激發(fā)光，而發(fā)射出可見(jiàn)光區的光。熒光探針只能吸收或發(fā)射一定波長(cháng)范圍內的光。探針的發(fā)射波長(cháng)總是大于其激發(fā)波長(cháng)，該波長(cháng)差值稱(chēng)為Stokes位移。
　　激發(fā)光譜指某種熒光物質(zhì)在不同波長(cháng)的激發(fā)下所測得的同一波長(cháng)熒光強度的關(guān)系，即不同激發(fā)波長(cháng)的相對效率。而發(fā)射光譜指該物質(zhì)在某一固定波長(cháng)激發(fā)下所測得的不同波長(cháng)熒光強度的關(guān)系，即不同發(fā)射波長(cháng)的相對效率。激發(fā)光譜的長(cháng)波部分和發(fā)射光譜的短波部分常重疊，這是分子內部能量轉換的結果。如圖所示，相應于不同波長(cháng)（EX1、EX2和EX3）的激發(fā)并不改變熒光的發(fā)射光譜，但其發(fā)射光（EM1、EM2和EM3）強度與激發(fā)光強度有關(guān)。

（二）熒光強度
　　熒光強度是表示熒光相對強弱的參數，它決定了檢測的靈敏度。其表達式為：

　　式中，F為熒光強度；K為儀器常數；Q為熒光量子產(chǎn)率；I₀為激發(fā)光的強度；ε為摩爾吸收系數；b為樣品池的光徑（樣品厚度）；c為樣品濃度。
　　摩爾吸收系數ε指染料吸收激發(fā)光的能力，而量子產(chǎn)率Q在數值上等于發(fā)射量子數與吸收量子數的比值，它與發(fā)射強度直接相關(guān)。各種熒光探針在（0.1, l）區間內有一個(gè)特征的量子產(chǎn)率，而只有當Q >0.4時(shí)才有實(shí)用意義。
（三）熒光壽命
　　熒光壽命又稱(chēng)激發(fā)態(tài)壽命，指熒光探針?lè )肿釉诩ぐl(fā)態(tài)的平均停留時(shí)間（τ）。大多數熒光探針的熒光壽命在納秒級。例如，FITC的τ值為4ns。熒光壽命短則可提高靈敏度。
（四）熒光探針的環(huán)境因素
　　適宜的溶劑極性、合適的pH值、猝滅劑濃度及其與探針?lè )肿拥挠H和性以及環(huán)境溫度等環(huán)境因素都會(huì )影響到熒光探針的產(chǎn)率。因此，應根據實(shí)驗要求選擇合適的探針和使用條件。
在選擇使用合適的熒光探針時(shí)應注意的兩個(gè)問(wèn)題如下述。
　　1 ．最大吸收波長(cháng)或最大發(fā)射波長(cháng)
　　應結合現有儀器的激光光源可以提供的工作波長(cháng)，選擇可供使用的熒光探針，并選用相應的濾光片。
　　2 ．光漂白
　　光漂白（photobleaching）也稱(chēng)光褪化效應（fading-out effect），使用時(shí)應盡量避免過(guò)度強光或長(cháng)時(shí)間照射，以免縮短樣品使用壽命。
　　下表為常用于生物醫學(xué)顯微技術(shù)中的熒光探針，僅供參考。應該指出的是，新的熒光探針不斷地被合成生產(chǎn)出來(lái)，在種類(lèi)和性能上不斷更新，可供選擇的可能性在不斷擴大。具體可以參考有關(guān)廠(chǎng)家的說(shuō)明材料或專(zhuān)著(zhù)如“handbook of fluorescent probes and research chemicals”（由美國Richard P . Haugland 著(zhù)，Molecular Probes公司出版）。
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